近年来，绿色分析化学(GAC)是可持续发展理念的一个关键问题，分析界致力于开发结合绿色化学原理的分析方法，以最大限度地减少对环境和人类的不利影响。在此，我们提出了两种可持续的、选择性的和有效的色谱方法。最初使用盐酸利多卡因(LDC)和硝酸咪康唑(MIC)两种防腐剂;对羟基苯甲酸甲酯(MTP)和糖精钠(SAC)采用薄层色谱-密度法进行色谱分析，流动相为乙酸乙酯:甲醇:甲酸(体积比为9:1:0.1)，紫外检测波长为220.0 nm，在0.3 ~ 3.0μg/波段范围内，MIC和LDC具有良好的相关性。随后，采用反相高效液相色谱法成功分离了LDC、MIC、MTP、SAC及LDC杂质的五元混合物;二甲基苯胺(DMA)采用C18色谱柱，梯度绿色流动相由不同比例的甲醇和磷酸盐缓冲液(pH 6.0)组成，流速为1.5 mL/min，紫外检测波长为210.0 nm, MIC的线性范围为1.00 ~ 100.00μg/mL, LDC的线性范围为2.00 ~ 100.00μg/mL, MTP和DMA的线性范围为1.00 ~ 20.00μg/mL。迄今为止，除了MTP和DMA外，没有关于这两种药物的测定记录。根据ICH指南验证了所提出的方法，并成功地应用于化合物的分析。方法的结果与报道方法的结果进行了统计学比较，在准确度和精密度上均无显著差异。使用不同的评估工具对这些方法的绿色概况进行了评估，并与报道的方法进行了比较。
盐酸利多卡因(LDC)在化学上被设计为2-(二乙基氨基)- n -(2,6-二甲基苯基)盐酸乙酰胺，图1a，它是一种局部麻醉剂，LDC组合可直接作用于皮肤和粘膜，通过抑制向内Na使该区域麻木。在钠离子层上的去极化电流，抑制轴突动作电位的传播，通常在几分钟内开始发挥作用，在局部麻醉或神经阻滞时持续30分钟至3小时[1,2]。列入世界卫生组织基本药物清单[3]硝酸咪康唑(MIC)为1-[(2RS)-2-[(2,4-二氯苯基)氧]-2-(2,4-二氯苯基)乙基)]- 1h -硝基咪唑，图1b, MIC是一种咪唑类抗真菌药物，是市场上应用最广泛的唑类药物之一[1]。MIC具有双重作用机制，第一种机制涉及抑制麦角甾醇的产生，另一种机制包括抑制过氧化物酶，导致细胞内过氧化物的积累，最终导致细胞死亡[4]。与LDC联合，作为抗真菌口服凝胶上市，用于治疗胃肠道和口咽腔念珠菌感染[5]
图1
盐酸利多卡因、硝酸咪康唑、对羟基苯甲酸甲酯、糖精和二甲苯胺的化学结构。盐酸利多卡因。b硝酸咪康唑(MIC)。c对羟基苯甲酸甲酯(MTP)d糖精(Saccharin)。e二甲基苯胺(DMA)
对羟基苯甲酸甲酯(MTP)是4-羟基苯甲酸甲酯，图1c。对羟基苯甲酸酯广泛应用于各种行业，作为防腐剂和抗菌剂[6,7]。对羟基苯甲酸酯是有效物质，但由于其对几种水生生物有害的名声，许多组织和科学界对其广泛使用存在争议，此外，由于这些物质对内分泌的干扰影响，包括乳腺癌和生殖系统问题，这些物质有许多健康问题，再加上一些出版物声称它们是致癌物质，因为它们可以表现出雌激素和抗雄激素活性，这些分子与癌症，特别是乳房肿瘤和男性不育有关[8]。对羟基苯甲酸酯也显示出通过经胎盘传播从母亲传给孩子的能力，产前接触对羟基苯甲酸酯对新生儿甲状腺功能和出生体重的影响已经被研究过，而且，一些研究表明，对羟基苯甲酸酯是导致持续性荨麻疹或血管性水肿的原因，因此，对羟基苯甲酸酯现在被认为是一种可能的健康危害[9]。这种新型化学物质在生态系统中越来越普遍，对环境、野生动物甚至人类都造成了危害。这种化学物质在生态系统中的存在增加了环境、动物甚至人类的负担[10]。因此，抗菌防腐剂作为对羟基苯甲酸酯在医疗产品中需要被证明是合理的，它们必须在分析和批放行过程中进行控制，并有必须满足的接受标准。MTP用于口服制剂，浓度范围为0.015%至0.2%[9]。
糖精钠(Saccharin sodium, SAC)的化学名称为2h -1λ6,2-苯并噻唑-1,1,3-三酮(SAC)，图1d, SAC是一种非药理活性物质，在口服药物配方中用作非营养性甜味剂，SAC的分离至关重要，因为它是与口服凝胶中的活性成分一起提取的。二甲苯胺(Dimethylaniline, DMA)是lddc的主要杂质，化学名称为N, N-Dimethylaniline，图1e，它是一种无药理活性的代谢物，被认为是lddc的主要降解产物[1]，因此，在药物配方中对其进行鉴定至关重要，因为它通过口腔粘膜和皮肤吸收，影响肾脏、肝脏和心脏等器官[11]。英国石油公司声称杂质限度为0.01% [1]
对手头文献的回顾揭示了许多方法，这些方法用于单独确定所研究的药物或使用各种分析技术与其他化合物组合。对于单独测定或与其他药物联合测定ldl，已有色谱法[12,13]、毛细管电泳法[14]和分光光度法[15,16]的报道，此外，对于用DMA估计ldl，也有分光光度法[17]、伏安法[18]和电化学方法[19]的报道。MIC可通过稳定性指示的高效薄层色谱法(High - Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)[20,21]、高效液相色谱法(High - Performance Liquid Chromatography, HPLC)、化学计量辅助紫外分光光度法[22,23]和伏安法[24]单独测定或与其他化合物联合测定。另一方面，对于MTP的测定，已发表了稳定性指示- HPTLC[25]、电化学[26]和分光光度法[27]等方法。[29]方法已被报道。据我们所知，目前仅有一种方法被报道，即HPLC-DAD法测定共配制凝胶剂型的最不发达度和最小不发达度[30]。
经查阅文献，目前尚无在SAC存在下LDC、MIC、MTP、DMA二元混合物分离测定的记录。
绿色分析化学(GAC)是21世纪出现的一种新方法[31]。这一新兴学科关注的是建立分析过程，限制刺激性化学品或试剂的使用，同时提高分析人员和环境安全[32,33,34]。近年来，方法学工具取得了重大进展，以尽量减少分析方法的负面影响[35,36]。遵循GAC的原则和建议对于在获得最大结果和最小化与分析方法相关的环境问题之间取得平衡至关重要[37]。意义一词代表GAC原则[31]:
分析方法的绿色评价方法应该是一个可靠的评价工具。应该对这样的工具进行评估、评估，并将其作为构建绿色分析方法的主要参数[37]。这些包括，例如，国家环境方法指数(NEMI)，这被认为是最传统的评估形式[38]，绿色分析程序指数(GAPI)[39]和最近建立的“分析绿色度量”(AGREE)[40,41,42]。
因此，本工作旨在建立绿色、简单、快速的TLC法测定LDC和MIC，该方法具有常规定量分析准确、选择性好、快速等优点，并能最大限度地减少样品制备、实验室消耗和材料成本[43,44]，在制药行业的研究和质量控制实验室中常用[45]。考虑到有必要对所述组合中可能存在的与LDC相关的有害杂质以及内分泌干扰物MTP进行识别和量化，RP-HPLC方法向前迈进了一步，因为它成功地分离并确定了凝胶配方中的LDC、MIC和MTP以及存在SAC的DMA，具有更高的精度、准确性和灵敏度。
采用薄层色谱法
扫描采用CAMAG TLC扫描器型号3S/N 1302139，使用winCATS软件(CAMAG, Switzerland)， CAMAG TLC自动进样器Linomat (CAMAG, Muttenz, Switzerland)，采用100.0μL微注射器。铝质TLC板预涂0.25 mm硅胶，荧光指示剂F254尺寸为20 × 20 cm(德国默克公司);
rp方法
高效液相色谱系统(型号1260无限系列;安捷伦，德国)由安捷伦四元泵(型号G1311C，序列号:DEAB816766)不同流量，配备光电二极管阵列检测器(型号G1315D, Agilent，德国，序列号:daax06967)和手动喷油器(型号G1328C，序列号:DEABG03628)， 20μL注射回路，系统由Agilent ChemStation软件操作。固定相采用Waters X Select?CSHTMC18色谱柱(250 mm × 4.6 mm I.D，粒径5μm)。使用Soniclean 160 T超声器(Soniclean, Thebarton, Australia)从药物剂型中提取药物。ph计(Jenway model 3505, UK)也被使用。
纯粹的标准
米康唑、对羟基苯甲酸甲酯、利多卡因和糖精的纯度分别为99.5%、98%、99.9%和98%，由Amriya Pharmaceutical Industries (Alexandria, Egypt)提供。2,6 -二甲基苯胺由Sigma-Aldrich(埃及)公司提供，纯度为99.9%。
制药配方
Micoban?口服凝胶(25 mg/6.6 mg)，批号5875003，标记为每克含有2.5% (w/w) MIC和0.66% (w/w) lddc，以及非活性成分:MTP和SAC，由埃及亚历山大的Amriya制药工业公司生产，并从埃及当地市场获得。
化学品和试剂
所用化学品为分析试剂级，溶剂为高效液相色谱级;甲醇、氢氧化钠(Sigma Aldrich，德国达姆施塔特)、磷酸二氢钾(E. Merck，德国达姆施塔特)、乙酸乙酯、甲酸(El-Nasr Pharmaceutical Chemicals Co.，埃及开罗)和双蒸馏去离子水(大冢，埃及开罗)。磷酸盐缓冲液pH 6.0(将2.72 g磷酸二氢钾溶解于1l双蒸馏去离子水中，用10%氢氧化钠调节pH至pH 6.0)[1]。
标准溶液
采用薄层色谱法
在甲醇中制备LDC、MIC、MTP和SAC的标准液，准确称重并将每种标准液的10.0 mg转移到10ml的容量瓶中，使每种药物的最终浓度分别达到1.0 mg/mL。
rp方法
配制LDC、MIC、MTP、DMA和SAC的标准液，浓度为1.0 mg/mL的甲醇，准确称重，将每种纯标准液25.0 mg转移到25ml的容量瓶中。将10.0 mL标准液分别转入100 mL容量瓶中，用甲醇补齐至标记，制备100.00μg/mL工作标准液。
色谱条件
采用薄层色谱法
样品分三次单独应用于TLC板上，条带长度为3.0 mm。这些带子被放置在离板底边缘15毫米的地方，间隔10毫米。色谱室预先用显影体系[乙酸乙酯:甲醇:0.1%甲酸(9:1:0.1，体积比)]在室温下饱和约30分钟。然后，用升层析法显影(7.5 cm)。显影后风干，在220.0 nm下扫描。
rp方法
使用甲醇(a)和磷酸盐缓冲液pH 6.0 (B)的梯度流动相，在注射前通过超声波脱气，以以下方式完成分离:以(80:20,v/v)开始2分钟，在接下来的2分钟内增加到(90:10,v/v)，该比例保持到运行结束，在运行之间进行3分钟的修复。色谱分离采用Waters X Select?CSHTMC18色谱柱(250 mm × 4.6 mm I.D，粒径5μm)，流速为1.5 mL/min，检测波长为210.0 nm，流动相和样品均经0.24 m过滤器过滤。进样量为20.0μL，所有测量均在室温下进行。
有限公司标定曲线的构建
对薄层色谱
将这两种药物精确测量的最低密度和MIC当量(0.3-3.0μg/波段)从其标准溶液(1.00 mg/mL)中转移，并使用100.0μL微注射器以波段形式应用于三个不同的TLC板上。在上述优化条件下显影后，风干，紫外灯下254 nm可见条带，220.0 nm扫描色谱图。绘制了平均积分峰面积与每一种最不饱和碳水化合物和MIC对应浓度(0.3 ~ 3.0μg/波段)之间的关系校正曲线。
对高效液相色谱法
将MIC为1.00 -100.00μg /mL, LDC为2.00 -100.00μg /mL, MTP和DMA分别为1.00 -20.00μg /mL的不同体积精确地从它们的原液中转移到10 mL的量瓶中，用甲醇-磷酸盐缓冲液pH 6.0 (50:50, v/v)稀释至标记。一式三份，将20.0μL的这些溶液注入柱中，并使用前面所述的优化条件进行色谱。通过绘制峰下平均面积与相关浓度的关系，并计算回归方程，建立校正曲线。
取1.0 g口服凝胶制剂准确称重，取50 ml烧杯，在甲醇中超声15 min，过滤入100 ml容量瓶，用甲醇完成体积。薄层法:薄层板上加10.0 μL;反相高效液相色谱法将2.0 mL声称含有(50.00μg/mL MIC和13.20μg/mL LDC)的等分液转移到10 mL的量瓶中，用甲醇-磷酸盐缓冲液pH 6.0 (50:50, v/v)完成。将制备的溶液在上述色谱条件下进行色谱，并根据相应的回归方程计算其浓度。
摘要。
介绍
实验
结果与讨论
结论
数据和材料的可用性
缩写
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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